熒光定量PCR儀驗(yàn)證

1.    什么是熒光定量PCR儀

熒光定量PCR儀是1996 年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種新型定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，在PCR進(jìn)行的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合配備的檢測(cè)器對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的儀器。所以熒光定量PCR儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，而非PCR結(jié)束之后，進(jìn)行收集的。目前SYBR Green I染料法和TaqMan探針?lè)ㄊ浅Ｓ玫膬煞NqPCR檢測(cè)方法。熒光定量PCR儀廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究如核酸定量分析；醫(yī)學(xué)研究如病原體檢測(cè)、腫瘤基因檢測(cè)；食品病原微生物的檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等等。目前的病毒核酸檢測(cè)絕大多數(shù)都是采用熒光定量PCR方法，對(duì)病毒RNA運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄后PCR的方式擴(kuò)增目的序列進(jìn)行檢測(cè)。

2.    熒光定量PCR儀的工作原理

將標(biāo)記有熒光素的探針與模板DNA混合后，完成高溫變性、低溫復(fù)性、適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光；隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

熒光染料：熒光染料也稱DNA結(jié)合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合，游離的SYBR Green I幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號(hào)可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大，其熒光信號(hào)強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。

熒光探針：常用的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針，該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí)，引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上，探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái)，從而使其發(fā)出熒光。檢測(cè)到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。

3.    術(shù)語(yǔ)解釋

(1) 基線：是指擴(kuò)增曲線的水平部分。是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線。

(2) 閾值：是一個(gè)熒光強(qiáng)度值，熒光域值必須設(shè)定在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。

(3) Ct值（閾值循環(huán)）是熒光定量PCR儀擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)的所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

(4) 擴(kuò)增曲線: 是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進(jìn)行PCR反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR管內(nèi)的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后將熒光信號(hào)值通過(guò)成像技術(shù)顯現(xiàn)在計(jì)算機(jī)上。正常的擴(kuò)增曲線包括四個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期、平臺(tái)期。

(5) 熒光強(qiáng)度精密度：均熱塊測(cè)量孔在同一熒光條件下熒光強(qiáng)度重復(fù)測(cè)量值的一致性。

4.    為什么要對(duì)熒光定量PCR儀進(jìn)行驗(yàn)證呢？

熒光定量PCR儀指通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程的儀器。結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。我們都知道進(jìn)行定性定量分析的儀器的要求都很高，況且熒光定量PCR儀比較敏感，結(jié)果比較精確，導(dǎo)致一點(diǎn)錯(cuò)誤的參數(shù)或者誤差就會(huì)出現(xiàn)*相反的數(shù)據(jù)結(jié)果。熒光定量PCR檢測(cè)儀在移動(dòng)、使用一段時(shí)間后，例如溫度系統(tǒng)引起的誤差；閾值循環(huán)數(shù)示值誤差、均勻度、精密度；通道峰值強(qiáng)度一致性；溶解溫度漂移、溫度比及各個(gè)要求的系數(shù)是否改變，能否達(dá)到我們需要的要求標(biāo)準(zhǔn)等等，都需要通過(guò)檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證它的各項(xiàng)參數(shù)是否處于正常范圍內(nèi)、是否符合要求，以防止該儀器在頻繁使用過(guò)程沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行合理的安排而產(chǎn)生誤差，對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果造成影響。所以熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行定期驗(yàn)證很重要，這樣既能確保我們的儀器一直處于良好、靈敏的工作狀態(tài)，也能保證我們做出的數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確性，降低試驗(yàn)室的風(fēng)險(xiǎn)。

5.    熒光定量PCR儀驗(yàn)證的項(xiàng)目如下

a.  溫度示值誤差

b.  溫度均勻度

c.  溫度最大過(guò)沖量

d.  平均升溫速率

e.  平均降溫速率

f.  閾值循環(huán)數(shù)示值誤差

g.  閾值循環(huán)數(shù)均勻度

h.  閾值循環(huán)數(shù)精密度

i.  通道峰值強(qiáng)度一致性

j.  線性靈敏系數(shù)

k.  溶解溫度漂移

l.  溶解溫度比

m.  熒光強(qiáng)度精密度

n.  樣本測(cè)量精密度

o.  熒光線性相關(guān)系數(shù)

p.  樣本線性相關(guān)系數(shù)

6.    熒光定量PCR儀操作過(guò)程中注意事項(xiàng)

a.  熒光定量PCR屬于精密性試驗(yàn)，需要專業(yè)人員操作，在操作過(guò)程中需要注意各方面細(xì)節(jié)實(shí)驗(yàn)以保證實(shí)驗(yàn)的可靠可重復(fù)性。

b.  實(shí)驗(yàn)室注意分區(qū)：試劑準(zhǔn)備間，樣本處理間，PCR室，電泳間要有明確區(qū)分，各房間實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)服不得混用；

c.  試劑準(zhǔn)備間及樣本處理間不處理實(shí)驗(yàn)相關(guān)的高濃度的核酸模板（如高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，PCR產(chǎn)物等）；

d.  減少頻繁多次的走動(dòng)，尤其去過(guò)電泳間之后當(dāng)天不可進(jìn)入其他房間；

e.  使用生物安全柜加樣，不同位置的移液器不可混用，不要隨意更換其位置；

f.  在檢測(cè)體系中添加UNG酶系統(tǒng)用于避免PCR產(chǎn)物的污染。

g.  條件允許，盡量使用一次性帶濾芯移液槍吸頭，使用非帶濾芯的吸頭的時(shí)候，移液器盡量不要使用最大量程移液，移液器盡量避免使用第二檔，防止打出氣泡，回彈污染移液器。

h.  加樣后將熒光定量PCR管瞬時(shí)離心，不要在熒光定量PCR管上做任何標(biāo)志，不能用手碰到PCR管蓋上的采光部位，以免影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

i.  熒光探針應(yīng)避光保存，加入核酸模板后應(yīng)盡快上機(jī)，以防探針淬滅。

7.    對(duì)與熒光定量PCR儀問(wèn)題解答

(1)      為什么熒光定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度應(yīng)該控制在80-300bp范圍內(nèi)？

答：每個(gè)基因序列長(zhǎng)短不一，有的好幾kb，有的幾百bp，但是我們?cè)谠O(shè)計(jì)引物的時(shí)候只需要要求產(chǎn)物長(zhǎng)度80-300bp，太短或者太長(zhǎng)都不適合做熒光定量PCR檢測(cè)。產(chǎn)物片段太短，無(wú)法跟引物二聚體區(qū)分，引物二聚體的長(zhǎng)度大概在30-40bp，小于80bp很難區(qū)分是引物二聚體還是產(chǎn)物。產(chǎn)物片段太長(zhǎng)，超過(guò)300bp，容易致使擴(kuò)增效率低下，不能有效的檢測(cè)出該基因的量。打個(gè)比方，我們統(tǒng)計(jì)某個(gè)試驗(yàn)室有多少個(gè)人，只需要數(shù)一下有幾張嘴就可以了，在檢測(cè)基因的時(shí)候也是一樣的，只需要檢測(cè)某個(gè)基因的某一段序列來(lái)代表整個(gè)序列即可。如果既要數(shù)多少?gòu)堊煲惨獢?shù)多少個(gè)鼻子、耳朵等反而容易數(shù)錯(cuò)。

(2)      引物設(shè)計(jì)最佳長(zhǎng)度是多少？

答：一般來(lái)說(shuō)，引物長(zhǎng)度大概在20-24bp范圍是比較好的。當(dāng)然我們?cè)谠O(shè)計(jì)引物的時(shí)候一定要注意引物的TM值，因?yàn)檫@個(gè)關(guān)系到最佳退火溫度。經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明，60℃是一個(gè)比較好的TM值。退火溫度太低容易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，退火溫度太高一般會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率比較低，擴(kuò)增曲線起峰比較晚，CT值延后。

(3)      采集樣本量的多少會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果？答：不會(huì)。

(4)      反轉(zhuǎn)錄酶效率高低會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果？

答：不會(huì)。這取決于各公司對(duì)于反轉(zhuǎn)錄試劑盒的優(yōu)化能力。

(5)      Taq酶的效率會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果？

答：Taq酶的效率影響比較大，一般要求用熱啟動(dòng)Taq酶，且效率要比較高才行，商品化的熒光定量試劑盒，每個(gè)廠家都會(huì)在自己的產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，把效率優(yōu)化到好的狀態(tài)，接近于100%，效率太低實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用。

(6)      熒光染料的多少會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果？

答：當(dāng)然是有影響的。熒光染料過(guò)于飽和，會(huì)導(dǎo)致某些儀器出現(xiàn)噪點(diǎn)干擾；熒光染料不飽和，熒光值太低，導(dǎo)致提前進(jìn)入平臺(tái)期，擴(kuò)增曲線平緩。在熒光定量實(shí)驗(yàn)中主要看CT值，因此后期擴(kuò)增曲線進(jìn)入平臺(tái)期顯得不那么重要，只是圖形不夠美觀罷了，如果二者必選其一的話，寧愿選擇熒光染料略微不飽和。在使用同一公司的同一款產(chǎn)品時(shí)，該影響基本可以忽略。

(7)      操作過(guò)程中的誤差會(huì)不會(huì)影響？

答：操作過(guò)程有一定的影響，主要體現(xiàn)在均一性上。均一性是指體系內(nèi)的所有組分均勻的混合在一起，瞬時(shí)離心可以解決均一性問(wèn)題。對(duì)于新手來(lái)說(shuō)，最好調(diào)整PCR體系在20ul以上，過(guò)小的體系更容易產(chǎn)生誤差。如果退火溫度優(yōu)化得合適，引物濃度對(duì)CT的影響會(huì)降到zui低。所以有的操作誤差（比如引物濃度）是可以通過(guò)優(yōu)化退火溫度來(lái)避免的。

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